Περιεχόμενο
- Ανίχνευση με χρήση αλλαγών χρώματος
- Χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA για μέτρηση
- Η άμεση ανταγωνιστική ELISA (κυτόχρωμα c)
- Επωάστε το πρωτεύον αντίσωμα σε σωληνάρια
Η δοκιμή ELISA είναι ένας ενζυμικός ανοσοπροσροφητικός προσδιορισμός που χρησιμοποιεί αντισώματα ή αντιγόνα συζευγμένα με ένα συγκεκριμένο ένζυμο για να βοηθήσει στον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αντισώματος ή αντιγόνου. Αν λαμβάνετε ELISA και δεν μπορείτε να χρησιμοποιήσετε συγκεκριμένα αντισώματα για να λάβετε τα αποτελέσματά σας, προτείνεται ανταγωνιστική ELISA επειδή χρησιμοποιεί ένα αντιγόνο συζευγμένο με ένα ένζυμο αντί του αντισώματος και μια διαφορετική μέθοδο ανίχνευσης.
Ανίχνευση με χρήση αλλαγών χρώματος
Ένα κοινό πρωτόκολλο για την ανταγωνιστική ELISA είναι η χρήση ενός μη σημασμένου και καθαρισμένου πρωτοταγούς αντισώματος. Το αντίσωμα επικαλύπτει τα φρεάτια μίας πλάκας μικροτιτλοδότησης και επωάζεται με άγνωστα πρότυπα. Ακολούθως προστίθεται ανοσογόνο για να συζευχθεί με το πρωτεύον αντίσωμα, το οποίο θα δεσμευθεί στις θέσεις αντισώματος που δεν έχουν ακόμη καταληφθεί. Ένα υπόστρωμα στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει μια αλλαγή χρώματος για τη μέτρηση της συγκέντρωσης δέσμευσης.
Χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA για μέτρηση
Χρησιμοποιήστε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης από πολυστερίνη και προσθέστε το πρωτεύον αντίσωμα σε κάθε φρεάτιο. Για να επιτευχθεί η μέγιστη δέσμευση, γεμίστε το φρεάτιο με ένα μικρογραμμάριο του αντισώματος. Επωάστε την πλάκα για τέσσερις ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Προσθέστε το πρωτεύον αντίσωμα δέσμευσης και πλύνετε τα φρεάτια με PBS (φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά). Επωάστε τις πλάκες με ρυθμιστικό δέσμευσης για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Πλένουμε τα φρεάτια δύο φορές πάλι με PBS και προσθέτουμε τα πρότυπα. Τοποθετήστε το διάλυμα αντιγόνου-συζεύγματος στα φρεάτια και επωάστε ξανά για δύο ώρες. Πλένουμε ξανά την πλάκα με PBS τέσσερις φορές. Προσθέστε το υπόστρωμα και μετρήστε τις πυκνότητες στο συγκεκριμένο μήκος κύματος χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ELISA.
Η άμεση ανταγωνιστική ELISA (κυτόχρωμα c)
Για μια άμεση ανταγωνιστική ELISA, πρέπει να γίνει ανάλυση αραιώσεως ορού για το αντιγόνο που χρησιμοποιείτε στο πείραμα. Η πλάκα μικροτιτλοδότησης επικαλύπτεται τότε με κυτόχρωμα c και επωάζεται όλη τη νύκτα. Το τμήμα ELISA της ανάλυσης στη συνέχεια εκτελείται με προσθήκη αντιδραστηρίου αποκλεισμού και δευτερογενούς αντισώματος. Τα αποτελέσματα απορρόφησης διαβάζονται με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.
Επωάστε το πρωτεύον αντίσωμα σε σωληνάρια
Σε αυτή τη διαδικασία, το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες στους οποίους συνδέεται το αντιγόνο ενδιαφέροντος. Τα δείγματα στη συνέχεια προστίθενται στα φρεάτια των πλακών μικροτιτλοδότησης και επωάζονται. Τα φρεάτια στη συνέχεια πλένονται για να απομακρυνθούν τα μη δεσμευμένα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος και στη συνέχεια προστίθεται το διάλυμα δέσμευσης για να αποτραπεί η σύνδεση του δεύτερου αντισώματος με τα φρεάτια. Το δευτερεύον αντίσωμα στη συνέχεια διαβάζεται σε έναν αναγνώστη πλάκας για να ληφθούν τα αποτελέσματα.